Stanford A型主动脉夹层组织切片中空间转录组学基因表达的可视化与分析

方法：我们收集了15例StanfordA型主动脉夹层患者的主动脉标本，随机选取1例升主动脉，进行10x基因组学和空间转录组学测序。在归一化、成分分析和降维分析的数据处理中，比较了不同的算法，建立了适合人体主动脉组织的路线。

结果：我们根据不同位置的基因表达计数水平识别了19879个基因，并根据基因表达趋势将它们分为七组。指出了群体中可能含有的主要细胞，不同细胞类型的主要分布不同，其中撕裂部位主要是巨噬细胞和干细胞。从参与免疫、调节氧稳态、调节细胞结构和基本功能等方面对这些不同部位的基因表达与它们可能包含的细胞类型进行了关联和讨论。

结论：这种方法提供了成人主动脉的空间分辨转录组和组织范围的视角，并将允许应用人的主动脉纤维组织，而不会对不同层次的低RNA表达水平的基因产生任何影响。我们的发现将为更好地理解斯坦福A型主动脉夹层的发病机制和异质性以及实施更有效的个性化治疗方法铺平道路。

AAD是一种严重的血管疾病，死亡率高，治疗选择有限。了解调节主动脉和AAD发生发展的不同细胞类型的生物学功能、网络和相互作用需要细胞信息和空间背景。因此，visium空间基因表达解决方案被提出用于研究人的主动脉夹层。在此，我们首次通过ST提供了一种用于主动脉组织分离和主动脉细胞类型数据质量控制的路线，并表明该流程可以应用于不同层次且RNA表达水平较低的人主动脉纤维组织。我们还初步描绘了升主动脉夹层的主动脉三层结构的分子图谱。此外，我们还展示了致病因子相关基因在主动脉组织中的位置信息，并详细阐述了信号通路在不同的主动脉细胞群中的表达模式。

visium空间基因表达解决方案最具挑战性的问题是升主动脉组织的总RNA提取和荧光捕获(与其他人类组织类型相比)，因为血管组织包含低密度的细胞和大量的纤维组织，因此实验变得困难。必须采取严格的预防措施，避免RNA在解离过程中降解，从而影响RNA的质量和产量。更复杂的是，在标准的RNA-seq中，整个组织被均质化，并获得整个样本内表达谱的平均表示。因此，基因表达的空间模式的信息被丢失，并且来自具有异常轮廓的细胞亚群的信号被遮蔽，例如那些在撕裂和功能障碍的中膜中具有低水平基因表达的细胞。为了克服这些不足，我们的目标是使用一种新的ST测序技术来分析人类AAD组织不同层次的基因表达，这种测序方法可以更精细地分析组织切片中的基因表达。我们覆盖了1,873个点，检测到了19,879个基因，同时发现了与特定细胞类型相关的基因表达。

此外，在分析过程中对不同的计算方法进行了比较，以确定最佳的处理路线。据我们所知，由于ST数据的高维度，基因长度和基因组覆盖的差异，以及细胞裂解和RT等过程中的实验误差，初步数据的标准化对后续分析结果的解释至关重要。图2I、J显示了每个基因与UMI数量之间的相关性。我们根据它们的平均表达和这些相关性的箱线图对基因进行了分组。对数归一化未能充分归一化前四组中的基因，这表明技术因素继续影响高表达基因的归一化表达估计。相反，SCTransform归一化大大减少了这种影响。对归一化后的数据进行主成分分析和独立成分分析。主成分分析假设原始分量彼此无关并且是正交的，而独立成分分析假设原始分量彼此独立。这两种方法都被用来鉴定群体中包含的细胞类型。为了避免细胞簇间的过度拥挤，获得最优的细胞簇，需要使用t-SNE和UMAP算法对进行了PCA和ICA降维的细胞簇进行再降维分析。图2N、P表明UMAP算法比t-SNE算法保留了更多的全局结构，特别是细胞子集之间的连续性。特定的路线使主动脉组织形态能够根据细胞注释的结果更有效地映射相应的空间位置。动脉包括丰富的多功能细胞群，每一种细胞都明显参与心血管疾病，如动脉粥样硬化和主动脉夹层。visium空间基因表达解决方案无法达到单个细胞的分辨率，这是一个不可避免的技术难题。我们只能根据基因表达模式对基因进行分类，然后根据现有的标记基因描述每一组可能包含的细胞。因此，使用了两个数据库来鉴定细胞类型，并通过多色免疫荧光验证了它们的准确性。我们首先提出了一种适当的方法来可视化细胞类型的空间转录图谱。因此，从每个特征性接收的单个个体转录本将提供空间基因表达谱。然后，我们在人类升主动脉夹层中鉴定了它们的异质性，这使得分析组织切片中对应于特定基因、位置分布和功能的各种细胞成为可能。许多研究使用scRNA-seq来描述血管细胞的异质性，包括血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞和主动脉外膜细胞在健康和疾病状态下的动脉。ST序列数据使用组合的SCTransform归一化、PCA dim 30和UMAP降维聚类法进行分析，以注释细胞类型。我们根据主动脉三个层次中七个簇的不同功能提供了三种主要血管细胞类型(血管结构相关细胞、血管发育相关细胞和免疫细胞)的特征性变化。同时，既可以观察到血管驻留细胞，包括SMCs、成纤维细胞和内膜细胞，也可以观察到浸润性免疫细胞，包括巨噬细胞、B细胞、T细胞和树突状细胞。在内膜中，我们发现了许多颗粒细胞、小胶质细胞和内皮细胞，这些细胞与健康的主动脉不同。这与动脉内膜的炎性浸润、血管壁的削弱、胞浆基质的降解以及内皮细胞引发的调节血流并招募免疫细胞的免疫反应有关。有必要在该领域进行补充研究，以进一步强调这一结果，并将其与主动脉其他部位的结果进行比较。在中膜中，鉴定出的细胞类型主要是SMC和VSMCs，它们具有维持稳定的血管结构的特殊功能。这些结果与赵等人报道的结果相似。根据转录谱的特征，免疫细胞占中膜撕裂部位细胞总数的80%以上，这可能在细胞对血压切应力的反应中起着重要的作用。与心脏的结果一致，健康的大血管似乎具有更多的内皮细胞异质性，而壁细胞表现出较少的转录可变性。我们还鉴定了许多干细胞；外膜干细胞或肌成纤维细胞也可能转分化为收缩表型，并迁移到中膜。在外膜细胞景观上又增加了一层多样性，ST测序发现了性腺内皮细胞和神经细胞，尽管驻留的巨噬细胞很少，但它吸引了免疫细胞。最大的细胞群是干细胞，它控制和维持细胞的再生，并在血管生成和重塑中发挥重要作用。

在疾病状态下，这些适应性变化不会恢复到基线水平，而是启动了AAD观察到的病理性血管变化。我们发现DEGs包括与细胞活动(AEBP1、ADIRF和Igfbp5)、炎症(MGP、BGN和SAA1)和神经元(CLU、MtCO2和ADH1B)相关的DEG，以及每个簇的基因和功能信号通路。KEGG通路富集注释显示，所有DEG在多个途径中显著丰富，包括15个在内膜(I1和I2/M2簇)，21个在中膜(M1、I2/M2、M3和M4)，20个在外膜(A1和A2簇)。它们在VSMCs丢失或功能障碍、蛋白多糖积聚、胶原和弹性纤维交联性紊乱和断裂等过程中发挥重要作用。此外，结果与观察到的细胞类型功能的异质性是一致的，这为后续研究提供了直接证据。初步的结果表明，AAD复杂机制引起的，这些机制参与血管损伤修复，因此是一个潜在的有趣领域。

我们的研究存在一些局限性。首先，由于这项研究包含的受试者数量有限，因此无法得出有关AAD疾病进展的结论。需要更多的样本来阐述细胞和主动脉夹层之间相互作用的潜在机制。其次，虽然ST序列允许同时表征主动脉内的细胞类型，但这些数据对AAD发病机制中的真实功能变化提供了一个有限的视角，这些变化无疑受到主动脉其他位置细胞过程的影响。为了提高结果的可靠性，还需要其他位置，包括主动脉弓、左颈总动脉和左锁骨下动脉。