Eike M. WÜlfers, et al. Quantitative collagen assessment in right ventricular myectomies from patients with tetralogy of Fallot. Europace 2020
摘 要
目的：
法洛四联症(TOF)患者通常伴右心纤维化，且因此受到心律失常的影响。本研究旨在评估TOF患者右心室流出道(RVOT)心肌中的纤维化分布，以评估单次组织学切片分析的实用性，并探索通过二次谐波成像(SHGI)量化未标记组织中纤维化的可能性，以替代基于组织学的传统分析方法。
方法和结果：
我们在11例TOF的RVOT样本中的量化了纤维变性，使用了特制的自动图像分析方法对天狼星红染色切片进行分析。在一组样本中，比较了基于组织学和SHGI的纤维化定量方法。纤维化分布具有高度异质性，在样本之间和样本内具有显著且可比较的变异性。我们发现，平均而言，每名患者10μm厚的67.8mm2的组织学处理组织，必须加以分析以进行精确的纤维化量化。SHGI可以更快地提供活体组织数据，并且量化胶原各向异性。
结论：
考虑到个体内的高度异质性，不应在TOF的RVOT切除肌肉的单个切片上进行纤维化量化。我们提供了一种用于组织学图像中纤维化量化的分析算法，使得其能够在TOF患者中进行所需的扩展容积分析。
正文图表
图1 组织切片的自动纤维化分析
图2 组织切片中自动和手动纤维化定量的比较
图3 组织切片中纤维化百分比的个体间和个体内变异性
图4 SHGI数据中的胶原纤维方向分析
讨 论
我们的发现强调:(I)TOF中的RVOT纤维化程度高(组织学数据中平均值为14.94±2.7%)，具有显著的个体间差异(单个患者样本与组平均值的平均偏差为5.20±4.58%；最大偏差15%)；(II)单个切片纤维化水平的个体内变异性显示出与个体间差异水平相似的变异性(一个切片与患者样本的平均偏差为6.59±3.25%；最大偏差12%)；(III)分析每个患者67.79 mm2(10mm厚组织切片)的平均组织面积是作为给定TOF患者的可靠纤维化评估代表的必要条件；以及(IV)从一个样本分组中采集SHGI数据得到的纤维化水平为12.21±10.55%，其可能具有对心肌组织结构进行活体评估的潜力，为进一步研究提供了令人振奋的方向。
我们提出了一种在心脏组织样本的2D组织切片中进行纤维化定量的自动化分析方法。自动和手动纤维化定量的比较表明，两种方法都能很好地从心肌中分离出相邻的含胶原结构，如增厚的心内膜或心内膜纤维弹性变性。手动组织学纤维化定量一般报告胶原百分比的结果值会低于自动分析(图2A)，我们将其归因于通过自动分割能够更精确地识别小胶原结构。因此，自动配对分析方法对于含有明显的弥漫性或点状胶原沉积样本特别有利。此外，自动纤维化定量比手动纤维化评估快1000多倍，使其成为一种省时有效的方法。
此处报告的自动分析组织学切片中的平均纤维化百分比为14.94%，略高于之前来自TOF的RVOT的报告，在该报告中，其中3-11%在组织学研究中是通过半自动的、基于颜色的量化观察到的，但与在其他右室区域中发现的纤维化类似(13-18%)。
个体间变异性(样本间胶原百分比在4.59%-29.98%之间)与一份先前的报告(6.0-27.5%)相似，略高于其他两份右室纤维化研究(9.7-18.3%和3.0-11.5%)。更重要的是，TOF的RVOT组织中存在明显的个体内异基因纤维化，其程度与个体间变异性相似(图3)。这种个体内变异性要求对平均面积为67.8 mm2 且10μm厚的固定、脱水后包埋组织进行分析，以可靠地量化RVOT组织中的纤维化。这与我们的术中切取的5-10个单独组织切片一致。对于体积为2-3 mm3的心内膜心肌活检组织被认为是最佳来源，如果其为立方体形状并经过仔细切割，则需要研究此类活检的大约35个组织学切片。因此，我们的数据强调，当量化TOF的RVOT切除肌肉或活检中的纤维化时，必须将基于单个切片的纤维化分析的实用性视为严重受限和非常容易出错的。
基于组织学的纤维化评估需要切除肌肉且耗时(即使使用自动图像分析)，因为样本需要脱水、包埋、切片、染色、盖片和成像。此外，必须获得高质量切片(无撕裂或褶皱且染色一致)，以进行稳定分析。相比之下，SHGI允许进行胶原成像，而不需要在成像前进行大量组织学方面的准备，包括从活组织中获取即时数据。探讨化学固定对表观纤维化含量的影响以及探索3D胶原分析的可能性，我们使用3D SHGI对五个患者的样本在其自然、存活(非固定)状态下进行成像，并在化学固定后对其进行重新评估。在我们的研究中，化学固定导致心肌组织体积收缩超过13%，而胶原结构则保持其尺寸。这与之前的报告相似，即化学固定可诱导平滑肌线性收缩2.7%(对应约为8%的体积效应)，同时胶原结构得以保留。经过相应的校正后，SHGI测定的胶原(体积-)百分比在活体和固定样本之间没有差异。这表明SHGI可用于在天然、非固定和未染色组织以及以及多聚甲醛固定的组织中，也可具有类似的结果，例如用于在之后的时间点检查心脏结构。这增加了基于SHGI的纤维化评估的实用性，尤其是对于罕见样本，如切除的人类心室心肌。
如我们的SHGI测量结果所示，化学固定导致样本中组织收缩约13%。Burtonet先前的发现表明，在进一步的组织学处理(不仅包括化学固定，还包括脱水和包埋)中，总组织收缩可能达到49%。因此，TOF的RVOT中代表性的纤维化定量所需的组织量可能超过新鲜组织的1 mm3。由于组织收缩取决于组织成分，尤其是胶原蛋白的存在程度(正如我们的研究结果和其他结果所证明的，胶原蛋白不太容易发生收缩)，我们并未尝试用文献中的单一值来校正我们的组织学数据。
通过SHGI进行纤维化量化的方法可以扩展到包括关于单个胶原纤维的信息，例如长度、宽度、体积和形态。由于胶原纤维取向影响完整心肌和心肌瘢痕中的心肌力学，我们研究了表征具有明显不同程度胶原各向异性的两个SHGI体积中3D胶原网络空间方面的可能性。我们能够通过SHGI识别和量化这些差异。
我们的数据证实，SHGI可能为活体心肌中的胶原定量提供一种组织保存选择，正如先前在非心脏组织中所报道的那样。胶原纤维网络的3D表征的可能性，以及与组织学相比具有更快的数据采集能力，使得SHGI成为研究心脏胶原结构的一种有前景的工具。最近的技术发展表明，甚至有可能进行活体双光子和/或SHGI显微镜检查，使用小型化的设备来缩小内窥镜的尺寸。Lianget al等人开发了一种光纤双光子/SHGI显微内镜平台，允许以组织学分辨率进行体内成像而没有光诱导组织损伤的迹象。当然，需要进一步优化以进行精确的内窥镜3D表征，特别是对诸如运动器官(如心脏)的表征，但原则上通过SHGI的最小侵入性体内纤维化评估可能变得可行。
