背景：主动脉瓣二瓣化畸形（BAV）有导致升主动脉扩张（AAD）的倾向，累及窦管交界以上部或主动脉根部。遗传因素被认为是升主动脉扩张发病的重要机制之一。我们推测罕见基因突变对主动脉根部的扩张有贡献。
方法：我们将主动脉根部或升主动脉直径大于等于40mm算作是升主动脉扩张，分为根部扩张组和管状部扩张组。利用二代测序技术对96例连续收集的散发BAV患者进行13个BAV相关基因的目标测序。收集基因频率小于0.05%的罕见基因突变进行分析。将突变频率与外显子组整合数据库（ExAC）中的数据进行比较。并根据美国医学遗传学与基因组学学会指南评价突变的致病性。
结果：我们在25例患者中鉴定出了27个罕见的非同义突变，涉及9个基因。负荷检验显示，GATA5，GATA6和NOTCH1的基因突变与BAV显著相关，80%的致病性突变在根部扩张组中被检出。根部扩张组的突变检出率（71.4%）显著高于正常主动脉组（29.0%）和管状部扩张组（29.6%）（p=0.018）。罕见基因突变是根部扩张的独立危险因素。[P=0.014，风险比=23.9,95% 置信区间（1.9-302.9）]
结论：我们的结果显示BAV患者拥有广泛的基因谱。其中，BAV相关基因的罕见突变与根部扩张的关系最为密切。
关键词：二瓣化畸形，二代测序，主动脉疾病，基因突变
背景
主动脉二瓣化畸形是一种常见的先天性心脏瓣膜缺陷，人群的发病率为0.5-1%[1,2]。有近一半的BAV患者会因为BAV相关的瓣膜或/和主动脉疾病（如主动脉瓣狭窄、主动脉瓣返流、主动脉瘤、主动脉夹层等）而接受药物或手术治疗[3]。BAV患者有很高的升主动脉扩张（直径大于4cm）风险[4]。他们当中，有约15%的患者在年轻的时候就会出现主动脉根部扩张并常伴随主动脉瓣返流[5]。在一个大的社区队列中，BAV患者发生主动脉瘤的风险要明显高于普通群体，并且有四分之一的BAV患者在确诊BAV后最终会接受主动脉手术治疗。BAV患者发生主动脉急症，特别是主动脉夹层的风险是普通人群的8倍[6]。
BAV相关主动脉疾病的潜在机制被广泛地讨论。目前存在两种相互竞争或者说更像是互补的BAV相关主动脉疾病机制假说，即血液流变学病因和基因因素。前者认为融合的瓣膜改变了血流，增加了升主动脉管内的剪应力[7]。从基因的角度看，基因缺陷会增加BAV相关主动脉疾病的发生风险[8]。然而到底哪种因素起到更重要的作用仍然是有争议的。
主动脉瓣和升主动脉具有部分胚胎起源共性[9]。因此可以合理假设BAV相关基因的罕见突变极有可能是诱发BAV主动脉疾病的风险因素，尤其是在主动脉根部。人类BAV合并主动脉疾病已经被证实与NOTCH1, TGFBR2, FBN1, 和SMAD6等基因的罕见突变相关[5,10]。
然而，我们对于影响BAV主动脉疾病临床表型的遗传因素认识还很有限。很可能在不同类型的BAV主动脉疾病中有不同的基因突变谱。利用下一代测序技术(NGS)我们对BAV相关基因进行目标重测序，目的是考察在一个精确定义了表型特征的大型BAV患者队列中基因突变的分布情况。
方法
研究人群
从2015年1月到2019年12月，连续招募了就诊于同济医院心脏大血管外科的130名无血缘关系的BAV患者。患者BAV的表型由超声心动图检测发现，并在术中经外科医生再次确认。如图1所示，BAV模式依据Siever等[11]所描述的表型分类来记录。入组的标准是在我院接受手术并同意参加这次研究的BAV患者。排除标准包括难以确定的瓣膜表型、合并复杂的先心病以及同时患有恶性肿瘤的患者。最终有96名接受了手术的患者被纳入研究。所有的参与者都是知情且同意的。院研究伦理委员会同意本项目的实施。
图1：二瓣化畸形患者的分类。a，这项研究中是BAV表型组成；b，正常主动脉瓣的解剖图（摄影师视角）；c，术中证实的二瓣化畸形表型分类。
主动脉的直径在至少两个层面进行了测量，主动脉窦层面以及升主动脉最宽处。根据2014年欧洲心脏病学会指南，主动脉直径扩张达到40mm及以上被认为是主动脉病变[12]。对于怀疑有主动脉疾病的患者，我们运用CT血管造影（CTA）来进一步评估其升主动脉的几何形态结构。主动脉根部扩张表型定义为主动脉最大测量直径位于主动脉窦部水平。管状部扩张则是主动脉最粗节段位于升主动脉。主动脉病变的分类如图2所示。
图2：主动脉病变分类。虚线处为主动脉的最宽部位，红线提示相应节段也有扩张。T1，升主动脉扩张伴正常主动脉根部；T2，升主动脉扩张伴主动脉根部增宽；R1，主动脉根部扩张伴正常升主动脉；R2，主动脉根部扩张伴升主动脉扩张。
目标下一代基因测序
我们应用Ion AmpliSeq™ 软件设计了一个包含13种BAV基因的定制引物集合（Panel），基因选取标准是BAV的致病基因和与BAV主动脉病变高度相关的基因。表1列出了这些基因和参考文献的PubMed唯一标识码。利用血液DNA试剂盒（天根生化科技，北京，中国）从外周血白细胞中获取基因组DNA。96个样本通过在Ion Proton（Life Technologies）平台上进行目标基因重测序来进行遗传学分析。
数据分析和筛选
测序数据由Ion Torrent Suite Software v5.0 (Life Technologies)进行处理，比对读长到人类基因组参考序列上（hg19/GRCh37）。当筛选的突变在在线数据库1000 genome Project或外显子组整合数据库 (ExAC)[13,14]中的基因频率<0.05%时，被认为是罕见突变。我们应用计算机预测算法:SIFT, Provan, PolyPhen2 [15]，和CADD[16]来预测鉴定出的非同义编码罕见突变的功能显著性。Phylop评分用于评价进化保守性。最后，我们根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMC)指南定义了突变的致病性[16]。
由NGS找到的罕见突变会使用自动DNA测序仪ABI 3130 XL (Applied Biosystems, Foster City, CA) 来进行验证。验证将根据操作手册使用Big Dye Terminator v3.1 试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)进行。
拷贝数变异（CNVs）
为了发现潜在的大片段基因组结构变化，如缺失、重复和其他拷贝数变异，所有测序区域的拷贝数通过扩增子覆盖数据进行分析。
罕见突变负荷分析
为了评估遗传变异对BAV的风险贡献度，本组患者中每个基因的合格罕见突变频率会和ExAC 远东数据库（East Asian database）中的数据相对比。对照组突变为所有ExAC 远东数据库中基因频率<0.05%的非同义变异和功能缺失变异。罕见突变负荷分析结果列于表1中。
数据分析
连续变量以均数±标准差表示，并用t检验或Mann-Whitney u检验进行比较，多组比较采用单因素方差分析。事后检验采用成对比较法。分类变量以百分比表示，并用Fisher精确检验或卡方检验进行分析，2×3列联表的事后检验采用校正的标准化残差分析进行。马赛克图被用来阐释主动脉构象与罕见变异之间的关系。蓝色单元格表示两个变量之间的正向关系。建立多因素logistic回归模型来分析主动脉病变的危险因素。所有的双侧P<0.05被认为是有统计学意义的。所有的统计学分析都是通过R version 3.2.5 (Vienna, Austria)来进行的。
结果
人口学特征
该研究共纳入96名患者，其中有74名男性，22名女性，平均年龄在44.6±13.0岁（范围从15到67岁）。有34名患者出现主动脉扩张（占所有患者的35.4%），在他们中，有22名患者因为主动脉瘤或主动脉夹层接受手术治疗。在本组病人中未发现主动脉缩窄病例。关于BAV类型，左-右型是最常见的类型，占所有BAV患者的三分之一（34.4%）。
测序数据
96名患者都接受了NGS检测。目标区域的平均覆盖深度是1406读长，测序中靶率是93.77%，99.01%的碱基测序覆盖率大于50×。在25个BAV患者中，通过靶向捕获共在9个基因上发现27个罕见的非同义编码突变。其中有两名患者分别携带有两个罕见突变。这些突变包括24个错义突变，1个移码突变，和2个终止突变。其中有14个突变之前未被ExAC和ClinVar报道。罕见变异的详细情况见补充文件1：表S1。
潜在的拷贝数变异通过聚合酶链反应进行验证，但未检测到大的缺失或重复片段。
罕见突变负荷分析
在13个BAV基因中，基因GATA5、GATA6和NOTCH1的罕见非同义编码突变频率在96例BAV患者队列中显著高于ExAC在线数据库。
基因型与表型的关系
携带有罕见突变的患者与未携带罕见突变的患者进行比较。如表2所示，这两组之间各变量并没有显著性差异。
紧接着，我们又考察了罕见突变在正常主动脉组和主动脉病变组中的分布情况（包括根部型和管状部型）。两组中的变异数相当，即正常组15个而主动脉病变组12个。有趣的是，罕见突变的构成比在两组之间有不同的分布特征。在正常主动脉组中，NOTCH1基因的突变频率占所有罕见突变的46.7%。与之相对应的，在主动脉病变组中NOTCH1基因的突变占所有突变的16.7%，尽管这个差异并没有统计学意义（P=0.217）。同时，主动脉病变组所牵涉的基因数量要比正常主动脉组多（8:5个基因）。图3形象的展示了罕见突变的分布特征。这提示了BAV相关主动脉疾病人群中的基因背景要比正常主动脉组的复杂得多。
BAV相关主动脉病变
有三分之一的BAV患者（35.4%，34/96）被诊断为罹患主动脉病变。我们比较了正常主动脉组，主动脉管状部病变组，和主动脉根部病变组的区别。管状部组的患者年龄最大，平均年龄是53.6岁。与之对应的是，根部组的患者最为年轻。管状部组的患者数量是根部组的4倍（27:7）。根部组的主动脉夹层发生风险（28.6%，2/7）要高于正常组（3.2%，2/62）和管部组（11.1%，3/27）（P=0.048）。值得注意的是，根部组无主动脉瓣钙化或感染性心内膜炎的病例。对比结果展示在表3当中。
在遗传因素对BAV主动脉疾病的影响方面，在根部组中有5个（71.4%）患者携带有罕见突变。而在管状部组和正常组中分别有8例（29.6%）和18例（29.0%）携带罕见突变。在所有BAV患者中根部病变患者拥有最高的罕见突变频率（P=0.021）。在图4的马赛克图中，表示罕见突变和根部病变关系的单元格是蓝色的，其Pearson残差是2.8，代表着罕见突变数目和根部病变例数是呈正相关的。此外我们还建立了关于根部病变风险的logistic回归模型，纳入了包括罕见突变、性别、年龄、体表面积、高血压、主动脉瓣疾病（关闭不全，狭窄，复合病变）和BAV分型（0,1,2型）。罕见突变被鉴定为独立的危险因素 [P=0.014, 危险度=23.9, 95% 置信区间 (1.9-302.9)]。
Figure4
讨论
在本研究中，我们报道用目标重测序技术检测BAV及其相关主动脉疾病罕见突变的结果。通过应用一个包含13个基因的引物集合，我们在96例患者中取得了26%的罕见突变检出率。据我们所知，本研究是规模最大的一组通过目标重测序技术在东亚人群中评估散发BAV疾病相关致病突变的队列。根据我们的数据，患有主动脉疾病的BAV患者要比主动脉正常的BAV患者具有更复杂的遗传异质性。主动脉根部病变与BAV基因的罕见突变强相关。
NGS技术的蓬勃发展为我们快速检测多个基因的多个变异提供了便利，从而使我们能够更全面地了解BAV和相关主动脉疾病的遗传学特性。Bonachea等人对78名无血缘关系的BAV患者进行了目标测序[17]。他们在16名受试者中鉴定出了31个可疑的致病性突变。Dargis等人应用一个包含9个BAV相关基因的引物集合来研究48个患者[18]，他们鉴别出了19个潜在的致病变异。在它们之中，NOTCH1的基因突变有7个，为所有有害突变数量之首。一些研究者也报道了与BAV相关主动脉病变的下一代测序结果。Girdauskas等人运用含有20个基因的引物集合研究63名有根部病变的BAV患者[19]。他们在15个候选基因中发现了有64个罕见突变，其中有24个是潜在或可能致病的突变。Gillis运用含有22个基因的引物集合来研究BAV/胸主动脉瘤的队列[10]。他们在441名患者中鉴定出了112个致病性突变。与之前的这些研究相比，我们的研究得到了类似的罕见突变检出率，这表明BAV可能是一个多基因性状的集合，有许多相互独立的基因与该疾病相关。
有一些研究指出BAV的主动脉扩张是本病的固有特征。在一项长期的随访研究中，研究人员观察到，即使不存在严重的主动脉瓣狭窄、反流和主动脉狭窄，BAV患者的主动脉仍然能够加速扩张[4]。尽管主动脉扩张的发病机制一直存在争论，遗传学说仍不断地被提到和研究。基于全基因组单核苷酸多态性阵列研究，人们发现BAV患者常常较早发生胸主动脉疾病，且这与重复拷贝数变异相关[20]。这些发现说明了BAV和主动脉疾病会有一些共同的分子发病机制，基因的缺陷可能会影响心脏和血管的正常发育从而导致了疾病的早发。
最近也有一些研究聚焦于BAV相关主动脉病变的基因起源。Pepe等人认为FBN1是导致BAV患者主动脉根部扩张的重要原因[21]。Gillis等人认为SMAD6的突变对BAV主动脉病变有很大的贡献，其突变负荷为2.5%[10]。在我们的研究中，主动脉扩张的患者中有着较广的的基因突变谱系，并没有哪个基因起到突出作用。
NOTCH1是第一个被证明同家族性与散发性BAV都相关的基因。Notch信号通路的异常会导致包括BAV在内的左室流出道畸形，并加快主动脉瓣疾病的进程[22]。然而NOTCH1突变究竟是否是导致BAV相关主动脉扩张的一个原因仍然存在争论。Girdauskas等人发现在63个BAV主动脉根部病变患者中有19位存在基因突变，且突变谱较广，而NOTCH1是首要致病基因[19]。与之相对的，Kent等人通过对13个BAV家族进行NOTCH1测序研究BAV相关的主动脉疾病。他们并没有在患者身上发现致病突变，于是得出结论NOTCH1基因突变对非钙化二叶主动脉瓣合并升主动脉瘤的致病贡献度较小[23]。激进的是，在另一个多中心的测序研究中，NOTCH1被认为是BAV相关的主动脉瘤的保护因素[10]。在项目队列中，我们从无血缘关系的患者中共发现了9个NOTCH1的非同义罕见突变，其检出率是9.4%。罕见突变携带者的表型也相互不同。总体而言，NOTCH1的突变在瓣膜功能不全合并正常主动脉的表型中要比主动脉病变表型更常见。我们的研究结果支持如下观点，即在BAV患者中NOTCH1相关机制具有异质性并且对于主动脉瘤外显率低。但不管如何，NOTCH1在BAV及其相关并发症中扮演着重要的角色。
根据以往的研究和我们的数据，BAV患者中主动脉根部扩张发生率在7.3%到13.5%之间[24]。这种主动脉扩张类型有进展快，不良主动脉事件发生风险高的倾向[24][25]。由于主动脉根部扩张表现为马凡综合征样主动脉根部形态特征，因此我们有理由认为遗传因素可能决定主动脉壁的缺陷，从而导致主动脉根部扩张。在本研究中，TGFBR1, TGFBR2, FLNA, 和FBN1的致病突变是主动脉根部扩张的原因。事实上，在这个连续性募集的BAV患者队列中，致病突变可解释57.1%的主动脉根部扩张，这是个引人瞩目的发现。
FBN1突变被发现与综合征型的或非综合征型的二瓣化主动脉瘤相关[21][26]。同时，FLNA缺陷被认为会导致包括大脑、骨骼、皮肤、心血管在内的各种发育畸形。根据Chen等人的研究，BAV在细丝蛋白病中发病率为5.3%，是最常见的心脏畸形之一。
在我们的研究中，根部扩张的患者缺乏典型的系统性结缔组织病的表型特征，其原因可能是突变的外显率降低。
由于表型的重叠以及某些突变的外显率较低，仅凭临床表现很难对BAV相关的主动脉疾病如原纤蛋白病和细丝蛋白病做出鉴别诊断。对BAV遗传背景的考察可以帮助人们提高对这些疾病的病理学认识。鉴于某些特殊基因的罕见突变是BAV及其相关主动脉病变的潜在调控子，分子诊断可以提高临床诊断的精确性，从而为患者的干预提供最佳指导并有助于制定更有针对性的治疗策略。
局限性
首先我们的参与者都来自于外科就诊患者，在评估遗传效应并推而广之到一般人群方面可能存在偏倚。其次我们的研究侧重于关注已知的BAV基因突变对疾病的影响。在更大的样本中进行全基因组测序可能会有助于扩宽我们对BAV及其并发症的遗传学视野。这些突变还需要进一步进行功能研究来评估它的相关性。对于评估罕见突变的潜在致病性，长期随访也是必不可少的。
结论
综上所述，这项目标下一代测序研究揭示了在一个大型BAV患者队列中有着广泛而特异的基因突变谱。从遗传学的视角来看，将主动脉疾病分为根部型和管状部型是合理的。BAV患者中根部表型有高的致病突变的频率负荷。携带有罕见非同义编码突变的患者其疾病进展会加快并在年轻时接受手术治疗。对于BAV的分子评估会有助于提高针对精确性并值得进一步研究。
作者：
马名嘉1, 李宗哲2, Mohamed Abdulkadir Mohamed1, 刘立刚1, 魏翔1*
本篇文章来源于微信公众号: CardiothoracicSurgery
